Pregunta: Experimento 1: Aislamiento de bacterias de muestras de suelo Una muestra de suelo típica tiene miles de millones de microorganismos debido a su composición húmeda y rica en nutrientes. Las bacterias comunes que habitan en el suelo incluyen: Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Micrococcus, coliformes (indicadores de contaminantes fecales), bacterias del

Experimento 1: Aislamiento de bacterias de muestras de suelo

Una muestra de suelo típica tiene miles de millones de microorganismos debido a su composición húmeda y rica en nutrientes. Las bacterias comunes que habitan en el suelo incluyen: Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Micrococcus, coliformes (indicadores de contaminantes fecales), bacterias del ácido láctico y Clostridium. Varios hongos (mohos) también se encuentran con frecuencia en las muestras de suelo. Estos organismos juegan un papel crítico en los diferentes ciclos biogeoquímicos naturales. Las bacterias satisfacen sus necesidades de nutrientes metabolizando la materia orgánica (plantas y animales en descomposición) en el suelo, oxidando y reduciendo así los elementos de la materia orgánica y devolviendo esos elementos al medio ambiente. En este experimento, examinará la diversidad de microorganismos del suelo cultivando bacterias de una muestra de suelo y realizando algunas pruebas microbiológicas para intentar identificar los microbios.

Materiales

solución salina estéril
3 esparcidores estériles

(9) Tubos cónicos de 15 ml con tapas de rosca Vaso de precipitados de 250 ml
10 pipetas de transferencia desechables estériles (8) de 5 cm. placas de Petri

Agar nutritivo ParafilmTM
1 par de guantes

Marcador permanente
Almohadilla caliente
Cilindro graduado de 10 mL
*1 cucharadita Muestra de suelo
*Microondas u otro baño maría hirviendo *Refrigerador
*Solución de lejía al 10 %

*Debes proveer

Procedimiento:
Prepare placas de agar nutritivo:

Afloje o retire la tapa de la botella de agar nutritivo.

Coloque el biberón en un microondas (si no tiene un microondas, coloque el biberón en un recipiente resistente al calor y

vierta agua hirviendo alrededor de la botella) y caliente hasta que se licue toda la botella de agar. Deberá quitar la botella y girarla cada 10 segundos para distribuir el calor.

Nota: Si nota que el agar se desborda, DETENGA el microondas y deje que la botella se enfríe antes de manipularla. El agar caliente puede explotar violentamente fuera de la botella si se calienta demasiado rápido y/o se agita. Después de que se detenga la ebullición, use una almohadilla caliente para protegerse las manos y retire la botella del microondas. ¡Tenga cuidado al sacar la botella del microondas ya que estará CALIENTE!

171

Microbiología Ambiental y Calidad del Agua

Agite suavemente la botella para mezclar la solución.

Vierta lentamente la solución de agar licuado en la mitad inferior de ocho placas de Petri de modo que cubra la totalidad.

fondo del neumático del plato. Es importante que se cubra todo el fondo y que se dé tiempo al agar para que se extienda por la placa.

Coloque las tapas en los platos y deje que el agar gelifique sin ser molestado. Esto debería tomar aproximadamente de 30 a 60 minutos. Si no va a usar los platos inmediatamente, guárdelos boca abajo en el refrigerador después de que se hayan gelificado por completo. Retire del refrigerador y déjelos reposar a temperatura ambiente durante al menos una hora antes de usarlos.

Mida y vierta 10 ml de solución salina en uno de los tubos cónicos de 1 a 15 ml.

Use un marcador permanente para etiquetar este tubo como "Solución de suelo común".

Utilice un marcador permanente para etiquetar 4 de los tubos restantes como "Normal 10 %", "Normal 1 %", "Normal 0,1 %" y "Normal 0,01 %". Etiquete el fondo de 4 de las placas de Petri con los mismos títulos.

Utilice un marcador permanente para etiquetar los otros 4 tubos como "10 % calentado", "1 % calentado", "0,1 % calentado" y "0,01 % calentado". Etiquete el fondo de 4 de las placas de Petri con los mismos títulos.

Mida y vierta 9 ml de solución salina en cada uno de los 8 tubos etiquetados.

Ubique 1 cucharadita. muestra de suelo Esto puede provenir de cualquier parte de su entorno local.

Agregue el suelo al tubo con 10 mL de solución salina (Solución Stock de Suelo) e invierta 10 veces para mezclar bien.

Prepare una dilución en serie de la solución madre de suelo:

Usando una pipeta de transferencia desechable estéril, transfiera 1 mL de la mezcla de suelo/solución salina al tubo Normal 10%; invertir 10 veces para mezclar bien.

Usando la misma pipeta de transferencia, transfiera 1 mL de la solución del tubo Normal 10% al tubo Normal 1%; invertir 10 veces para mezclar bien.

Transferir 1 mL de la solución del tubo Normal 1% al tubo Normal 0,1%; invertir 10 veces para mezclar bien.

Transferir 1 mL de la solución del tubo Normal 0,1% al tubo Normal 0,01%; invertir 10 veces para mezclar bien.

Con una pipeta limpia para cada tubo, transfiera aproximadamente 0,1 ml (o unas 4 gotas) de cada tubo normal a cada placa de Petri correspondiente. Extienda la solución de suelo diluida uniformemente sobre la placa con un esparcidor estéril separado. Deje secar al aire.

172

Microbiología Ambiental y Calidad del Agua

Enrosque firmemente la tapa del tubo de solución madre de suelo y sumerja el tubo en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Retire con cuidado el tubo del baño y sumérjalo en un vaso de agua fría del grifo durante 5 minutos.

Prepare una dilución en serie de esta solución madre de suelo calentada en los tubos calentados como en los Pasos 13 - 16.

Prepare las placas de distribución de la solución de suelo calentada y diluida como en el Paso 17.

Incube ambos juegos de placas en un lugar cálido (que no supere los 37,7 °C o 100 °F) durante 1 o 2 días (hasta que

aparecen colonias bacterianas bien definidas; esto puede llevar más tiempo para las muestras calentadas).

Preguntas posteriores al laboratorio:

1. Observa los dos juegos de placas. Determine las CFU/mL de cada solución (normal y calentada), recordando usar una placa que tenga entre 30 y 300 colonias (pista: consulte la práctica de laboratorio 8: Cuantificación). ¿Hay alguna diferencia en los recuentos de UFC/mL para las dos condiciones de tratamiento? ¿Qué explica esta diferencia?

2. ¿En qué se diferencian las colonias de las dos condiciones de tratamiento (p. ej., tamaño, color, forma, etc.)?

3. ¿Qué efecto tiene el procedimiento de calentamiento y enfriamiento sobre las bacterias presentes en las muestras de suelo?

4. ¿Cuál es el origen de las colonias bacterianas en las muestras calentadas?